Analisis Sperma WHO 2021

1. Abstinensia ejakulasi 2–7 hari. Catat jumlah harinya.
2. Ambil dengan masturbasi ke wadah steril bermulut lebar yang tidak toksik bagi sperma. Jangan memakai kondom biasa atau pelumas.
3. Seluruh ejakulat harus tertampung. Bila ada yang tumpah, terutama bagian awal yang paling banyak mengandung sperma, catat sebagai sampel tidak lengkap.
4. Beri label: nama, No. RM, tanggal, dan jam ejakulasi. Sampel dari rumah dikirim dalam 1 jam pada suhu 20–37 °C (didekap dekat tubuh).
5. Letakkan wadah di inkubator 37 °C atau meja kerja. Amati likuefaksi tiap 15 menit. Normalnya sempurna dalam 15 menit; lebih dari 60 menit dicatat likuefaksi tertunda.
6. Homogenkan dengan memutar wadah perlahan. Jangan dikocok atau di-vortex.
7. Volume: timbang wadah (berat wadah kosong sudah dicatat); 1 g dianggap 1 mL. Jangan mengukur dengan menyedot ke spuit atau pipet.
8. pH: teteskan pada kertas pH rentang 6–10 setelah likuefaksi, paling lambat 1 jam. Baca dalam 30 detik.
9. Viskositas: tarik semen dengan pipet berlubang lebar; benang lebih dari 2 cm berarti meningkat. Semen kental dapat dilewatkan 6–10 kali melalui jarum tumpul 18–19 G, atau dicampur bromelain 10 IU/mL 1+1 (faktor pengenceran ikut dihitung).

1. Homogenkan semen, ambil 10 µL dengan pipet (sebaiknya positive displacement).
2. Teteskan di tengah kaca objek bersih, tutup dengan kaca penutup 22 × 22 mm. Kedalaman cairan sekitar 20 µm sehingga sperma bebas berenang. Hindari gelembung udara.
3. Tunggu sekitar 60 detik sampai aliran cairan berhenti.
4. Periksa pada pembesaran 400×, sebaiknya mikroskop kontras fase dengan meja penghangat 37 °C.
5. Pilih minimal 5 lapang yang berjarak lebih dari 5 mm dari tepi kaca penutup. Di tiap lapang hitung semua sperma progresif dulu, lalu non-progresif, lalu imotil.
6. Hitung 200 sperma pada tetes pertama, lalu buat tetes kedua dan hitung 200 lagi (replikat).
7. Sekaligus catat perkiraan sperma per lapang (untuk memilih pengenceran), aglutinasi, agregasi, dan sel bulat.

1. Isi tabung dengan pengencer fiksatif sesuai tabel (200 µL, 950 µL, atau 2.450 µL).
2. Homogenkan semen dengan memutar wadah. Ambil 50 µL semen memakai pipet positive displacement, seka bagian luar ujung pipet dengan tisu tanpa menyentuh lubangnya.
3. Keluarkan semen ke dalam pengencer, bilas ujung pipet dengan mengisap dan mengeluarkan cairan beberapa kali.
4. Pasang kaca penutup khusus hemositometer: basahi sedikit kedua penyangga, geser dan tekan kaca penutup sampai tampak cincin Newton (garis pelangi). Ini tanda kedalaman tepat 0,1 mm.
5. Vortex campuran 10 detik, lalu segera ambil sekitar 10 µL.
6. Sentuhkan ujung pipet ke tepi kaca penutup pada alur pengisian kamar A. Cairan masuk sendiri secara kapiler. Jangan sampai meluber ke parit, jangan kurang, dan jangan ada gelembung.
7. Vortex lagi, ambil 10 µL baru, isi kamar B dengan cara yang sama.
8. Simpan hemositometer dalam cawan Petri beralas kertas saring basah (ruang lembap) 10–15 menit supaya sperma mengendap di dasar kamar dan tidak mengering.
9. Periksa pada 200–400×. Hitung grid tengah (grid 5) baris demi baris sampai minimal 200 sperma dan baris terakhir selesai. Hitung kamar B dengan jumlah baris yang sama.
10. Hanya sperma utuh (kepala + ekor) yang dihitung. Kepala yang terletak di garis ikut aturan garis atas–kiri (lihat simulasi).
11. Bila selisih kamar A dan B melebihi batas, buang campuran lama, buat pengenceran baru, dan ulangi.

Eosin-nigrosin (apusan)

1. Campur semen dan larutan eosin-nigrosin sama banyak, misalnya 50 µL + 50 µL, di tabung kecil. Tunggu 30 detik.
2. Teteskan 10 µL campuran ke kaca objek, buat apusan tipis seperti apusan darah, keringkan di udara.
3. Periksa pada 1000× imersi minyak dengan cahaya biasa.
4. Kepala putih = hidup. Kepala merah atau merah muda tua = mati. Warna merah muda samar yang hanya di daerah leher tetap hidup.
5. Hitung 200 sperma pada tiap apusan, dua apusan.

Eosin saja (preparat basah)

5 µL semen + 5 µL eosin Y 0,5% di kaca objek, tutup kaca penutup, periksa dalam 30 detik pada 200–400×.

HOS test

100 µL semen + 1 mL larutan hipoosmotik (natrium sitrat dihidrat 0,735 g + D-fruktosa 1,351 g dalam 100 mL akuades), inkubasi 37 °C 30 menit, lalu buat preparat basah 10 µL. Ekor membengkak atau melingkar = hidup.

1. Siapkan 2 kaca objek bersih berlabel.
2. Teteskan semen di dekat ujung kaca: 5 µL bila konsentrasi > 20 ×10⁶/mL, 10–20 µL bila lebih rendah. Bila sangat sedikit, pekatkan dulu: sentrifugasi 600 g 10 menit, buang sebagian supernatan, campur kembali.
3. Teknik tarik: letakkan kaca kedua bersudut ±45° di depan tetesan, mundurkan hingga menyentuh tetesan dan cairan menyebar sepanjang tepinya, lalu dorong perlahan dan rata ke depan.
4. Keringkan di udara, lalu fiksasi (untuk Papanicolaou: etanol 95% minimal 15 menit).
5. Warnai dengan Papanicolaou modifikasi (baku WHO), Shorr, atau Diff-Quik.
6. Periksa pada 1000× imersi minyak cahaya terang. Telusuri lapang secara sistematis dan nilai hanya sperma utuh yang tidak tumpang tindih.
7. Gunakan kriteria ketat: sperma yang meragukan (borderline) digolongkan abnormal. Nilai 200 sperma per apusan, dua apusan.

Warna Papanicolaou: akrosom biru pucat, daerah post-akrosom biru tua, midpiece merah muda–merah, ekor biru atau kemerahan, sitoplasma sisa merah muda.

1. Sentrifugasi seluruh sisa semen 3000 g selama 15 menit.
2. Buang supernatan, sisakan sedikit cairan, campur pelet.
3. Periksa seluruh pelet dalam beberapa preparat basah 10 µL di bawah kaca penutup 22 × 22 mm.
4. Ditemukan sperma = kriptozoospermia. Tidak ditemukan = azoospermia.
5. Bila volume sangat sedikit atau tidak ada ejakulat, periksa urin pasca-ejakulasi untuk menilai ejakulasi retrograd.